Miopatia mitochondrialna z wadą transportu mitochondrialnego-białka ad

Większość włókien wykazywała niewielki nadmiar obojętnych kropli lipidowych. Nie było poszarpanych czerwonych włókien, ale 9 procent włókien miało negatywny wpływ na oksydazę cytochromu c. Barwienie histochemiczne dehydrogenazy bursztynianowej wykazało rzeczywisty brak tego enzymu we włóknach mięśniowych, ale normalny poziom w mięśniach gładkich naczyń. Próbki mięśni do mikroskopii elektronowej zaciśnięto na długość spoczynkową, utrwalono w 3 procentach aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze kakodylanu sodu przy pH 7,4, po utrwaleniu w procentowym wodnym tetratlenku osmu i osadzono w araldycie. Cienkie skrawki zostały zamontowane na siatkach miedzianych o średnicy oczek 200 .m i zabarwione nasyconym metanolowym octanem uranu i wodnym cytrynianem ołowiu. Mikroanaliza rentgenowska z dyspersją energii została przeprowadzona na osmowanych, ale nie wybarwionych odcinkach przy 80 kV, przy użyciu systemu Link AN / 85S dołączonego do elektronowego mikroskopu elektronowego Jeol 1200EX. Metoda ta wykorzystuje precyzyjnie skupioną wiązkę elektronów do sondowania obszarów submikronowych próbki i ujawnienia ich zawartości pierwiastkowej poprzez analizę widm indukowanej fluorescencji rentgenowskiej.
Ryc. 1. Ryc. 1. Mikrograf elektronowy zbioru mitochondriów blisko powierzchni myofibera. Układ ich cristae jest nienormalny, a wiele z nich ma gęstą ziarnistą inkluzję w swoich matrycach. Pasek jest równy .m.
Mikroskopia elektronowa wykazała, że wiele włókien zawiera małe, powierzchowne skupiska mitochondriów z nieuporządkowanymi kryształami labiryntu, z których wiele ma nieregularne, gęste, ziarniste wtrącenia w ich matrycach (ryc. 1). Rozproszone mitochondria wewnątrzmięśniowe głębiej we włóknach miały podobne cechy. Mikroanaliza rentgenowska rozpraszająca energię wykazała, że gęste inkluzje intramitochondrialne zawierały znaczne ilości żelaza i że stężenia fosforu, siarki oraz w mniejszym stopniu potasu i wapnia były również zwiększone w stosunku do stężenia w sąsiadujących obszarach matrycy mitochondrialnej bez gęstej inkluzje. Zawartość żelaza we wtrętach mitochondrialnych była taka, że później można było wykazać histochemicznie reakcję Perla (dane nie pokazane).
Analiza biochemiczna
Mitochondria wyizolowano w ciągu 90 minut od biopsji, jak opisano wcześniej. Oczyszczone preparaty mitochondrialne zastosowano natychmiast do polarograficznego oznaczenia poboru tlenu i do niskich temperatur (77 kelwinów) pomiarów cytochromów.8 Testy enzymatyczne przeprowadzono zgodnie ze standardowymi technikami. 11 12 13 Oszacowania białka przeprowadzono zgodnie z metodą Lowry i wsp., 14 z albuminą surowicy bydlęcej jako standardem. Próbki do analizy polipeptydów przechowywano w ciekłym azocie w obecności 5 mmol aminobenzamidyny na litr (stężenie końcowe) w celu ograniczenia proteolizy. Próbki uzyskane od sześciu osobników bez klinicznych, morfologicznych lub biochemicznych dowodów miopatii mitochondrialnej były używane jako kontrole. Mitochondria wyizolowane z próbki pobranej z biopsji mięśnia od innego pacjenta (pacjent 2) z miopatią mitochondrialną i niedoborem kompleksu III zostały użyte do porównania profili polipeptydów immunoblotów. Wszystkie badania zostały przeprowadzone za świadomą zgodą uczestników lub ich rodziców oraz za zgodą wspólnego komitetu etycznego Narodowego Szpitala Chorób Nerwowych i Instytutu Neurologii.
Do analizy polipeptydów złożonych I próbki solubilizowano w 2% dodecylosiarczanie sodu (wag./obj.), 5% merkaptoetanolu (wt / vol), 10% glicerolu (obj./obj.) I 6,25 mM chlorowodorku TRIS, pH 6,8, i gotowano przez dwie minuty przed rozdzielaniem na żelach dodecylosiarczanu-poliakryloamidu z liniowym gradientem od 12 do 16 procent.3, 15 Próbki do analizy kompleksów II, III i IV rozpuszczono w 5 procentach dodecylosiarczanu sodu (wag./obj. ), 2% merkaptoetanolu (vol / vol), 8 M mocznika i 0,25 M chlorowodorek TRIS, pH 6,8, przed rozdzieleniem na żelach dodecylosiarczanu sodu / poliakryloamidu; w kompleksach II i III zastosowano gradient od 12 do 16 procent, a dla kompleksu IV zastosowano gradient od 12 do 19 procent
[podobne: obrzęki pochodzenia sercowego, masaż limfatyczny po mastektomii, nystatyna ulotka ]