Miopatia mitochondrialna z wadą transportu mitochondrialnego-białka cd

Po zakończeniu elektroforezy białka zostały poddane elektrotlencji na nitrocelulozę. Filtry nitrocelulozowe moczono przez noc w temperaturze pokojowej w 1-procentowej mieszaninie proszku mlecznego Marvel w roztworze soli buforowanym fosforanem, pH 7,4. Do sondowania filtrów użyto różnych swoistych dla holoenzymów i specyficznych dla podjednostek przeciwciał wzbudzonych do wysoko oczyszczonych kompleksów I, II, III i IV z serc wołowych17 18 19. Aby określić pozorne masy cząsteczkowe pewnych polipeptydów, filtry wybarwiono złotem, sfotografowano, a następnie immunoblotami. 20 Związane przeciwciała wykrywano za pomocą kompleksu peroksydazy streptawidyna-biotyna-chrzan.
Aby zbadać wpływ traktowania proteinazą na białka reagujące krzyżowo z przeciwciałem specyficznym dla białka Rieske w Kompleksie III, świeże nietknięte mitochondria z wątroby szczura zostały przygotowane zgodnie z opisem Hayes i wsp. 21 i podzielone na dwie próbki. Jedną próbkę eksponowano na końcowe stężenie proteinazy K (15 .g na mililitr; Sigma) przez 30 minut w 0 ° C. Proteolizę zatrzymano przez inkubację z mM fluorku fenylometylosulfonylu (stężenie końcowe) przez pięć minut w 0 ° C. Obie próbki następnie zamrożono, aż przepuszczono je na 14-procentowym żelu z dodecylosiarczanem-poliakryloamidem, przeniesiono na nitrocelulozę i wykryto przeciwciałem swoistym dla białka Rieske.
Mapowanie peptydów przeprowadzono zgodnie z modyfikacją metody opisanej przez Cleveland i wsp.22 Próbki kontrolne ludzkiego mięśnia i oczyszczonego kompleksu III z serc bydła23 rozdzielono na 14-procentowych żelach dodecylosiarczanu sodu / poliakryloamidu o grubości 0,75 mm równolegle z Rainbow. znaczniki masy cząsteczkowej (Amersham). Po zakończeniu elektroforezy wycięto na żelu 1-centymetrowy wycinek zawierający znaczniki 30 kd (w celu włączenia białek o względnej masie cząsteczkowej 20 do 30 kD), a następnie rozdzielono na poszczególne składniki. Paski następnie zrównoważono i wprowadzono na 1,5-mm żel z 5,5-centymetrowym żelem do układania w stos i 5,5-cm żelem rozdzielającym (gradient liniowy, 15 do 19 procent). Plastry żelu nakładano za pomocą proteazy V8 (0,05 lub 0,1 mg na mililitr) i poddawano elektroforezie przy 10 mA przez żel stosowy i przy 20 mA przez żel rozdzielający, aż frakcja barwnika osiągnęła dno głównego żelu. Oddzielone peptydy przeniesiono na nitrocelulozę, a następnie poddano immunoblottingowi z przeciwciałem swoistym dla białka Rieske.
Wyniki
Badania polarograficzne i enzymatyczne
Tabela 1. Tabela 1. Analizy polarograficzne, cytochromowe i enzymatyczne mitochondriów od pacjenta i od sześciu normalnych kontroli. Ryc. 2. Ryc. 2. Mitochondrialny łańcuch oddechowy. TMPD oznacza tetrametylo-p-fenylenodiaminę, koenzym CoQ Q, Cyt cytochrom c, ADP difosforan adenozyny i Pi fosforan nieorganiczny.
Szybkość wchłaniania tlenu w obecności pirogronianu, glutaminianu i bursztynianu była znacznie niższa niż normalnie, a szybkość podawania askorbinianu i tetrametylo-p-fenylenodiaminy była tuż poniżej normalnego zakresu (tabela 1). Poziomy cytochromów b, c i c były prawidłowe, ale poziomy cytochromu aa 3 nieznacznie spadły. Aktywności dehydrogenazy bursztynianowej, bursztynianowej reduktazy cytochromu c, wrażliwej na Rotenon reduktazy NADH cytochromu c i oksydazy cytochromowej były znacznie zmniejszone w porównaniu z wartościami kontrolnymi
[więcej w: przerost błony śluzowej nosa, trombomodulina, neurografia ]