Stowarzyszenie oparte na rodzinie między chorobą Alzheimera i wariantami w UBQLN1 czesc 4

TV1 zawiera 11 eksonów, podczas gdy w wariancie transkrypcyjnym 2 (TV2), egzon 8 jest alternatywnie odszczepiany, bez żadnego wynikającego z przesunięcia ramki odczytu. UBQLN1 ma dwa motywy strukturalne, domenę podobną do ubikwityny (UBL) i domenę związaną z ubikwityną (UBA), które znajdują się odpowiednio na N-końcu i na C-końcu białka. Domeny te zostały zaangażowane w celowanie i degenerację białek przez szlak ubikwityna-proteasom. Domena UBA jest również częścią C-końcowej sekwencji aminokwasowej odpowiedzialnej za wiązanie prezenilin. Strzałki wskazują miejsca starterów reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) stosowanych do amplifikacji TV1 i TV2. Panel B pokazuje detekcję fragmentów PCR TV1 i TV2 w agarozowym DNA z komplementarnego DNA ludzkiego mózgu z użyciem starterów specyficznych dla eksonów 7 i eksonu 9. Amplifikacja TV1 i TV2 dawała odpowiednio 244-bp i 160-bp fragmentów. Sekwencyjność fragmentów PCR dla UBQLN1 potwierdzono przez sekwencjonowanie. AD oznacza chorobę Alzheimera. Panel C porównuje stosunek transkryptów TV2 do TV1 w korze skroniowej od 25 pacjentów z chorobą Alzheimera i 17 osobami kontrolnymi (po lewej), a także w odniesieniu do genotypów UBQ-8i (po prawej). Test U Manna-Whitneya zastosowano do porównania stosunku transkryptów TV2 do TV1 między pacjentami z chorobą Alzheimera i osobami kontrolnymi; zastosowano jednoczynnikową analizę wariancji w celu porównania współczynników TV2-do-TV1 wśród grup genotypowych UBQ-8i. Dwudziestu sześciu pacjentów miało genotyp TT (13 z nich miało chorobę Alzheimera), 13 miało genotyp CT (10 z nich miało chorobę Alzheimera), a 3 miało genotyp CC (z których 2 miało chorobę Alzheimera), gdzie C jest ryzykowny allel i T alternatywny allel. Niektóre symbole na wykresach pokrywają się. Łącznie 58 polimorfizmów pojedynczego nukleotydu zidentyfikowano w trzech genach kandydujących na chorobę Alzheimera przez bezpośrednie sekwencjonowanie DNA od dotkniętych i niedotkniętych chorobą członków powiązanych rodzin (tj. Tych z najwyższymi statystykami podziału alleli według z publicznie dostępnych baz danych (patrz Dodatek dodatkowy). Genotypy pojedynczego nukleotydu-polimorfizmu zostały wygenerowane przy użyciu metody wydłużonej jednoporcjowej metody polaryzacji fluorescencyjnej, w wysokowydajnym systemie detekcji fluorescencji Criterion Analyst (Molecular Devices). Wstępne badania równowagi i nierównowagi oraz kontroli jakości dały w sumie 19 pouczających polimorfizmów pojedynczego nukleotydu do genotypowania i analizy w pełnej próbce NIMH (7 polimorfizmów pojedynczego nukleotydu, każdy w polimorfizmach ABPA1 i ABCA1 i 5 pojedynczych nukleotydów w UBQLN1). Cztery z polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w UBQLN1 (rs2780995, UBQ-8i, rs2781002 i UBQ-10e) również zostały genotypowane w rodzinach CAG, a UBQ-8i genotypowano w próbkach mózgu do analizy funkcjonalnej. Rysunek 2 pokazuje lokalizację wariantów UBQLN1, a dalsze szczegóły znajdują się w dodatkowym dodatku.
Funkcjonalne analizy UBQ-8i w próbkach mózgu
Ekstrakcja RNA
Część szarej substancji z górnego bruzdy skroniowej (30 do 50 mg) wycięto z każdego mózgu w ostrych warunkach wolnych od RNazy zgodnie z wcześniej opublikowanymi metodami. Z każdej próbki, RNA ekstrahowano odczynnikiem Trizol zgodnie z instrukcjami producenta ( Invitrogen) (patrz dodatek dodatkowy).
PCR odwrotnej transkryptazy
RNA potraktowane DNazą (2 .g) poddano odwrotnej transkrypcji do komplementarnego DNA (cDNA) przy użyciu losowych heksamerów zgodnie z instrukcjami producenta (Invitrogen), ale z 200 U odwrotnej transkryptazy Superscript II (Invitrogen) stosowanej w każdej reakcji.
Ilościowa analiza żelu agarozowego wariantów transkrypcyjnych i 2 UBQLN1
Specyficzne dla UBQLN1 startery PCR z eksonu 7 i eksonu 9 zaprojektowano do wykrywania transkryptu wariantu (TV1, numer dostępu GenBank, NM_013438) i wariantu transkrypcji 2 (TV2, numer dostępu GenBank, NM_053067), które obejmują odpowiednio i brak egzonu 8 ( Dodatek ten zawiera warunki PCR i sekwencje starterów)
[podobne: ginekomastia cz 4, ciśnienie osmotyczne krwi, przewód stenona ]
[przypisy: ciśnienie osmotyczne, ciśnienie osmotyczne krwi, tętno nitkowate ]